农杆菌|它们改「邪」归「正」，成为自然界的小小遗传工程师

农杆菌是什么？

它们是「Bad Brothers」，生活土壤中，偷偷附着在植物根系表面。植物受伤后，受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物指引「Bad Brothers」来到伤口处，它们逃过植物的「安保系统」，乘虚而入，诱发植物「肿瘤」，被感染的植物会出现冠瘿瘤和发根等畸形症状，生长受到限制。而它们会以此根瘤为据点，吸收植物的营养来进行自我繁殖。
 

后来，科学家发现它们是导致植物「肿瘤」的「罪魁祸首」，是重要的植物致病菌。其中两种农杆菌（Agrobacterium），根据它们各自的「坏技能」分别被起名为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。

图 1.农杆菌分类
 

科学家发现根癌农杆菌和发根农杆菌中分别含有的独立于染色体外的环状大质粒 Ti(Tumour inducing) 质粒，Ri（Root inducing）质粒是致病元凶，两种质粒结构相似。

 

图 2.农杆菌致病症状

不同类型的野生型 Ti 质粒大小在 180～250 kb。T-DNA 区（Transfer DNA），由左边界 LB、右边界 RB 及致瘤基因：生长素 (Auxin) 基因、细胞分裂 (Cytokinin) 基因、冠瘿碱（Opine）合成基因的 DNA 序列组成，农杆菌感染植物后 T-DNA 区会插入植物基因组中。但它不能独立完成该工作，需要其他功能区协助。Vir 毒性区（Virulence Region），可激活 T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，使农杆菌表现毒性。ORI 区（Origin of replication，质粒复制起始点），调控 Ti 质粒自我复制。

图 3.Ti质粒结构示意图（图片来源于Wikipedia）

大部分双子叶植物、裸子植物细胞损伤后，分泌大量酚类化合物，吸引附近的农杆菌聚集到伤口处侵入植物组织间隙，同时诱导 Ti 质粒上 vir 基因表达，T-DNA 区在农杆菌中被剪切下来，并通过特定通道到达植物细胞，最后进入细胞核整合到植物基因组中。被感染的植物因整合了 T-DNA 区，可以合成出冠瘿碱（Opine），农杆菌利用冠瘿碱代谢基因将冠瘿碱分解为氨基酸和糖类，供农杆菌作为氮源和碳源使用。而 T-DNA 区中生长素基因、细胞分裂基因的表达使植物激素失调，导致植物细胞不正常增殖，形成树瘤。
 

虽然农杆菌 Ti 质粒对植物百害无一利，但它们是可以实现 DNA 转移和整合的天然系统：将目的基因插入 T-DNA 区的特定位置，通过农杆菌感染可实现将外源目的基因重组到植物基因组中，再生出转基因植株。但野生型 Ti 质粒很大（180～250 kb），缺乏有效的酶切位点，难以插入外源基因，而且包含对研究无用的长序列致瘤基因，这几个因素都导致它不能直接应用于植物转基因技术。
 

所以在利用农杆菌介导法进行植物转化时，科学家「扬长避短」，删除 Ti 质粒上生长素基因、细胞分裂基因、冠瘿碱合成基因，增加筛选标记（如抗性基因），多克隆位点。农杆菌 Ti 质粒系统是目前植物基因工程中最常用的载体系统。根据 Ti 质粒诱导合成的冠瘿碱（Opine）的类型，分为章鱼碱型 Ti 质粒、胭脂碱型 Ti 质粒、农杆碱型 Ti 质粒、琥珀碱型 Ti 质粒。

农杆菌介导的植物转基因常用的是双元载体系统，将 Vir 区和 T-DNA 区分别放在两个相容的质粒上。Ti 辅助质粒携带 vir 基因，整个转基因过程一直位于农杆菌中；在大肠杆菌中构建的 T-DNA 给体载体携带有 T-DNA 的两个边界重复序列 LB，RB，和克隆在 LB，RB 之间的目的基因，最后在农杆菌中和 Ti 辅助质粒协助完成目的基因转移。两种质粒分别独立存在时无法完成植物转基因。
 

常见植物表达载体有 pBI121(Chen PY,et al. Mol. Breed. 11, 287-293 (2003))，pCAMBIA1300(Hajdukiewicz,P.et al. Plant Mol. Biol. 25 (6), 989-994 (1994)) 等。常用农杆菌感受态见下表。
 

目前转基因植物中大约有 80% 以上都是通过“农杆菌介导法”得到，农杆菌是名副其实的自然界小小遗传工程师^*1。