干货|RNA-Seq应用案例分析

案例1：哺乳动物组织转录组分析

哺乳动物由于其基因组大小很大并且很复杂（高重复、高杂合），导致其转录组研究比较困难。在“Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq”中Mortazavi等研究员结合Illumina测序平台，对成年小鼠的脑、肺、骨骼肌组织RNA进行转录组高通量测序及分析（4100-5200万个25碱基对图谱），大于90%的位置与已知外显子相匹配，同时也发现了新的和未修改过的基因，包括改变或增加启动子、外显子和3’未转录区域。约3000个新鉴定的3’UTR，可能在microRNA介导的转录后水平和翻译水平调控中起重要作用；约3000个新鉴定的5’外显子，提示有新的启动子序列被利用。尤其在RNA剪接方面，该研究利用高通量测序获得的海量数据，对比到约2×10^5种可能剪接方式的数据库，鉴定出1.45×10^5种不同的剪接方式，其中可变剪接占主导，3500个基因拥有至少一种内部剪接方式。

图1.Reads比对区域占比
 

该研究成果表明，RNA-Seq技术不仅能够检测到低丰度转录本，而且可以发现未知转录本，精确识别可变剪接位点，提供全面的转录组信息，是目前深入研究转录组复杂性的有力工具。

案例2：物种间表达差异

虽然人类大脑中注释基因的表达已经被广泛地描述，但我们对位于已知基因边界之外的转录本的范围和保存的知识是有限的。在“Intergenic and Repeat Transcription inHuman, Chimpanzee and Macaque Brains Measured by RNA-Seq”中Augix Guohua Xu等研究者利用RNA-Seq技术研究了人、黑猩猩和恒河猴三个物种的大脑在不同年龄段的基因表达量。所有物种中，只有20–28%的转录本可以比对到注释的外显子区，20–23%的转录本比对到内含子上，来自内含子和基因间区的重复序列占大脑转录组的40–48%。一些重复家族表现出转录本拷贝数升高。在非重复基因间区，研究者鉴定出1093个在人大脑中显著高表达的区域。这些区域在灵长类RNA表达水平和哺乳动物DNA序列水平都具有保守性。20%的转录本在已知基因的3’UTR有延伸，这可能在可变microRNA调控基因表达中发挥作用。最后，研究者发现物种间的转录组表达差异随着进化时间的增加而逐渐增大，相比外显子，基因间区转录本表现出更大的差异表达。

该研究结果显示，RNA-Seq技术发现人大脑中存在很多尚未鉴定出的进化保守的转录本，并且其中一些转录本可能在转录水平调节和人特有的表型特征进化中起作用，为从分子水平上揭示大脑发育机制提供了有效方法。

以下为部分结果展示：

案例3：水稻转录组分析

在真核生物中，掌握转录组的动态变化对研究转录调控的复杂性以及转录调控对表型的影响至关重要。在过去的几十年里，水稻因其农业价值而被广泛研究。在“Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the ricetranscriptome”中Zhang等研究者运用RNA高通量双向深度测序技术，首次展现了水稻八个组织部位的转录本表达图谱全貌，并且能够精确检测到丰度非常低的转录产物，获得相当可观数量的全新转录本、外显子、非编码区。经生物信息学基础分析和深度分析，揭示了顺式剪接在水稻基因中占33%以上，234个推测嵌合转录本可能由反式剪接产生，大量融合转录本可能是可变剪接的副产品，其数据量和信息量远远高于已有报道。RNA-Seq技术使水稻转录组信息得到了极大的丰富，帮助研究者更全面的认识转录本的多样性和复杂性，拓展了未来农业研究的领域。